Огляд діагностикумів для ДМП, підготовлений МДЛС СОЗТ

01/08/2025

Д-р Паола Де Бенедикт, д-р Крістін Фелнер-Гардінер, д-р Конрад Фройлінг, д-р Томас Мюллер та д-р Райан Воллес

Сказ — це заразна й смертельна хвороба, що викликається Ліссавірусами, що вражають центральну нервову систему. Оскільки немає явних патогномонічних уражень чи специфічних, постійних клінічних ознак, Сказ неможливо надійно відрізнити від інших неврологічних інфекцій, спираючись лише на клінічну картину. Тому необхідна лабораторна діагностика валідованим методом. Міжнародні стандарти діагностики Сказу описані в «Главі 3.1.19. Сказ (зараження вірусом Сказу й іншими Ліссавірусами)» Посібника з діагностики й вакцинопрофілактики для наземних тварин (Посібник наземних тварин) Світової організації здоров’я тварин (СОЗТ).

Огляд діагностикумів для дослідження Сказу на місці події («експрес-тестів»), підготовлений мережею довідкових лабораторій по Сказу (RABLAB) Світової організації здоров’я тварин

WOAH Rabies Reference Laboratory Network’s (RABLAB) overview of LFD tests for field application

Основні автори:

Д-р Паола Де Бенедіктіс, д-р Крістін Фельнер-Гардінер, д-р Конрад Фройлінг, д-р Томас Мюллєр та д-р Райан Воллєс.

Учасники RABLAB:

© Світова організація здоров’я тварин, 2025
Зображення обкладинки: © Halo, Південна Африка

Вступ

Сказ — це заразна й смертельна хвороба, що викликається Ліссавірусами, що вражають центральну нервову систему. Оскільки немає явних патогномонічних уражень чи специфічних, постійних клінічних ознак, Сказ неможливо надійно відрізнити від інших неврологічних інфекцій, спираючись лише на клінічну картину. Тому необхідна лабораторна діагностика валідованим методом. Міжнародні стандарти діагностики Сказу описані в «Главі 3.1.19. Сказ (зараження вірусом Сказу й іншими Ліссавірусами)» Посібника з діагностики й вакцинопрофілактики для наземних тварин (Посібник наземних тварин) Світової організації здоров’я тварин (СОЗТ).

Для тварин, що гинуть після захворювання з ознаками Сказу, надзвичайно важливою є своєчасна діагностика Сказу. Однак в умовах обмежених ресурсів логістичні проблеми часто перешкоджають доставленню зразків до лабораторії, або лабораторії не в змозі проводити міжнародно визнані діагностичні дослідження. Як і у випадку з іншими хворобами, ДСМП є альтернативним варіантом, що дозволяє здійснювати епізоотичний нагляд за Сказом, сприяє швидкому реагуванню та збільшує кількість виявлених випадків хвороби.

На ринку доступні кілька діагностикумів для дослідження Сказу на місці події – комерційні швидкі імунохроматографічні діагностикуми, також відомі як пристрої латерального потоку (ПЛП), для виявлення антигену вірусу Сказу. Ці набори для швидкого дослідження Сказу прості у використанні, не потребують додаткового обладнання чи тривалого навчання і надають результати впродовж кількох хвилин. Хоча ці діагностикуми не включені до сертифікованого Реєстру СОЗТ діагностичних наборів і не підтверджені, як придатні для використання, їх застосування явно не виключається. Однак їх застосування потребує ретельного розгляду.

Щодо характеристик діагностикумів для дослідження Сказу на місці події, мережа довідкових лабораторій СОЗТ СОЗТ з виявлення Сказу (RABLAB) зазвичай посилається на останні поправки до Посібника з діагностики й вакцинопрофілактики для наземних тварин СОЗТ.

У цьому документі узагальнено поточні знання мережі довідкових лабораторій СОЗТ з виявлення Сказу (RABLAB) про комерційно доступні діагностикуми для дослідження Сказу на місці події (ДСМП), включаючи технічні характеристики, вартість, переваги й обмеження кожного з них. Діагностикуми були обрані на основі рецензованих публікацій, в яких оцінювалися дослідження чи платформи, чи на основі незалежних оцінок, проведених в лабораторіях авторів. Важливо підкреслити, що, хоча ДСМП можуть слугувати корисним доповненням до діагностики Сказу, вони не мають замінити лабораторні дослідження в державних програмах офіційного контролю Сказу.

Принцип дослідження

Принцип ДСМП базується на імуноафінному розділенні, чи імунохроматографії, в якій аналіт мігрує в сторону через пористу мембрану до визначеної зони «афінності», що містить іммобілізовані антитіла.

Для дослідження на Сказ суспензію тканини мозку наносять на лунку для зразка досліджуваної касети, де вона абсорбується в касету для дослідження. Потім зразок проходить через прокладку з кон'югатом, що містить антитіла (Abs) проти Сказу, мічені наночастинками золота (Мал. 1).

Малюнок 1. Зображення пристрою з латеральним потоком для виявлення антигену вірусу Сказу

Якщо антиген вірусу Сказу присутній, то комплекси антиген-антитіло, мічені наночастинками, мігрують вздовж мембранної смужки й реагують з досліджуваною смужкою (лінія «Т»), що містить специфічне антитіло проти Сказу. Ця взаємодія утворює видиму кольорову смужку (Мал. 2). У міру того як суспензія продовжує рухатися до контрольної смужки, антитіло до IgG, покрите лінією «C», реагує з міченими наночастинками антитілами проти Сказу, в результаті чого утворюється контрольна смужка. Щоб дослідження було дієвим, реагенти мають правильно текти вздовж мембранної смужки, а кон'югат, навантажений наночастинками – зв'язаними з антигеном або незв'язаними (як у негативному зразку) – має реагувати з контрольною лінією антитіла до IgG, підтверджуючи правильність дослідження.

Малюнок 2. Фотографії дослідження на Сказ з використанням пристрою для бічного потоку, що показують позитивний (ліворуч) і негативний (праворуч) результат.

Примітка: Внутрішня контрольна смужка підтверджує лише правильність проходження антитіл для виявлення вздовж смужки. Вона не підтверджує наявність цільового антигену.

Фактори, що впливають на результати діагностики Сказу на місці події

На відміну від інших лабораторних методів діагностики, рекомендованих СОЗТ, діагностикуми для ДСМП є готовими до використання наборами. Хоча це робить їх зручними у використанні, це також і обмежує можливості лабораторних експертів змінювати протоколи.

Як і з будь-яким діагностичним дослідженням, перед використанням діагностикумів для ДСМП важливо розуміти їх можливості й обмеження. На їхню ефективність здатні впливати кілька факторів:

• Фактори, що стосуються набору чи партії: до них належать ефективність міток для виявлення, якість мембрани, швидкість потоку, методи посилення сигналу, а також чіткість і послідовність інструкцій виробника.

• Умови довкілля й обробки: до них належать температура та вологість зберігання, дотримання інструкцій, кваліфікація оператора в зборі зразків та простота інтерпретації результатів.

Поширеним обмеженням комерційно доступних наборів діагностикумів для ДСМП є відсутність позитивних і негативних контролів. Хоча кожна дослідна смужка містить внутрішню контрольну лінію, ця лінія лише підтверджує, що антитіла для виявлення правильно протікали вздовж смужки; вона не виконує функції справжнього позитивного контролю в строгому сенсі цього слова.

Ефективність досліджень на основі антигенів, таких як ДСМП, значною мірою залежить від характеристик використовуваних антитіл для виявлення Сказу та їх афінності до цільового антигену. Це безпосередньо впливає на чутливість і специфічність дослідження. Антитіла для виявлення не мають вступати в перехресну реакцію з антигенами, що не належать до Сказу, оскільки неспецифічне зв'язування здатне призвести до хибнопозитивних результатів. Оскільки афінність антитіл залежить від конкретного варіанту, вибір відповідних антитіл для ДСМП є критичним фактором, що визначає, які варіанти Ліссавірусу та вірусу Сказу буде виявляти дослідження. З огляду на глобальну різноманітність Ліссавірусів, включаючи віруси Сказу, антитіла, що використовуються в цих дослідженнях, мають бути досить реактивними.

Подібно до кон'югатів проти Сказу для прямого дослідження на флуоресцентні антитіла (DFA), антитіла до нуклеопротеїну (N) мають вищу чутливість для виявлення антигену вірусу Сказу порівняно з антитілами до глікопротеїну (G). Це пояснюється тим, що білок N:

• Є найпоширенішим структурним білком вірусу Сказу, що полегшує його виявлення в інфікованих тканинах.
• Є висококонсервативним у різних штамах вірусу Сказу, що забезпечує широкий спектр і надійність виявлення.
• Виробляється на ранній стадії реплікації вірусу, що дозволяє виявити інфекцію раніше, аніж за допомогою глікопротеїнів.

Сучасні комерційні поліклональні анти-N антитіла, як правило, є більш ефективними, аніж моноклональні антитіла (mAbs), оскільки вони здатні розпізнавати всі Ліссавіруси. На відміну від цього, анти-N моноклональні mAbs антитіла здатні проявляти різну реактивність до певних Ліссавірусів чи навіть до різних варіантів вірусу Сказу. Однак використання коктейлю з двох чи більше моноклональних mAbs антитіл дозволяє подолати обмеження окремих моноклональних антитіл, тим самим суттєво підвищуючи діагностичну чутливість ДСМП.

Іншим важливим фактором, що впливає на ефективність ДСМП, є межа виявлення (МВ). На щастя, концентрація антигену вірусу Сказу у мозку скажених тварин зазвичай дуже висока, що, як правило, не створює проблем при ДСМП. Однак у випадках, коли тварини досліджуються на ранній стадії клінічних проявів або коли зразки мозку є неоптимальними, вірусне навантаження може бути низьким. У таких ситуаціях нижча МВ підвищує діагностичну чутливість, дозволяючи виявляти навіть мінімальні кількості антигену вірусу Сказу.

Діагностичну чутливість і специфічність ДСМП слід оцінювати за допомогою точної валідації дослідження, в ідеалі проведеної відповідно до міжнародних стандартів. Виробник несе відповідальність за валідацію ДСМП відповідно до цих стандартів (див. Главу 1.1.6. Посібника з діагностики й вакцинопрофілактики для наземних тварин СОЗТ) з метою забезпечення стабільної чутливості й специфічності для кінцевих користувачів та підтримання високої якості продукції. Крім того, інструкція, що додається до діагностичного набору, має чітко відображати процедури, що використовуються під час процесу валідації.

Чи слід використовувати дослідження Сказу на місці події для діагностики Сказу?

Поширене запитання, що ставлять органи влади й відповідь на нього потребує ретельного розгляду того, чи слід використовувати ДСМП для діагностики Сказу. Див. табл. 1 для повноцінного порівняння. Іншими словами, чи мають ДСМП таку ж діагностичну цінність, як і інші дослідження, рекомендовані СОЗТ?

Таблиця 1. Порівняння трьох основних дослідницьких платформ для виявлення вірусу Сказу

На сьогодні на ринку представлено щонайменше 17 різних комерційних швидких імунохроматографічних діагностикумів для дослідження Сказу на місці події, що здатні виявляти антиген вірусу Сказу. У багатьох оцінювальних дослідженнях інструкції виробника були змінені, що може суттєво вплинути на ефективність дослідження. Під час оцінювання чутливості й специфічності конкретного аналізу ДСМП важливо враховувати будь-які відхилення від інструкцій виробника і потенційний вплив на ефективність дослідження. Деякі дослідження навіть повністю провалили оцінювання, тоді як інші залишаються неоціненими (Eggerbauer et al., 2016, Klein et al., 2020).

Хоча деякі огляди ефективності дослідження надали оцінки чутливості й специфічності для різних ДСМП, їх не можна визнати повністю валідованими відповідно до інструкцій виробника. Таким чином, вони не відповідають очікуванням кінцевих користувачів, які покладаються на готові до використання дослідження. Для більшості ДСМП дані валідації або недоступні, або не відповідають критеріям, викладеним в Главі 1.1.6. Посібника з діагностики й вакцинопрофілактики для наземних тварин СОЗТ. Крім того, часто бракує прозорості щодо методів аналізу, зокрема їх складу й реакційності використовуваних для виявлення антитіл.

З огляду на значну варіабельність у роботі комерційних ДСМП й серйозні ризики для здоров'я людей, що виникають внаслідок хибнонегативних результатів через низьку чутливість – мережа довідкових лабораторій СОЗТ з виявлення Сказу (RABLAB) не рекомендує використовувати ДСМП як самостійне діагностичне дослідження для виключення зараження Сказом.

Чи є дослідження Сказу на місці події усе ще корисним?

Попри наявні обмеження, мережа довідкових лабораторій СОЗТ з виявлення Сказу визнає потенційну цінність ДСМП як інструментів скринінгу для підтримки епізоотичного нагляду за Сказом в ензоотичних районах, коли доступ до рекомендованих СОЗТ діагностичних досліджень недоступний.

Однак, належне використання ДСМП має визначатися компетентним органом. Економічна ефективність включення цих досліджень до програм нагляду за Сказом залишається предметом дискусій і, ймовірно, залежить від конкретних програмних цілей та місцевого епізоотичного контексту Сказу. Якщо країна чи ветеринарний орган не визнали ДСМП як офіційний метод дослідження Сказу, то позитивні й негативні результати ДСМП не мають використовуватися для офіційної статистики нагляду чи офіційного визначення стану відносно Сказу. І навпаки, якщо країна чи ветеринарний орган прийняв ДСМП як офіційний метод дослідження Сказу, то позитивні результати мають бути включені до офіційної статистики нагляду.

Якщо ДСМП використовуються як діагностичні дослідження для нагляду за Сказом, мережа довідкових лабораторій СОЗТ з виявлення Сказу рекомендує наступне:

• Використовувати для дослідження лише матеріал мозку.
• Використовувати лише високопродуктивні ДСМП з чутливістю щонайменше 90% та специфічністю 95%. Станом на квітень 2025 року два дослідження можуть відповідати цим очікуванням (тобто демонструвати вищу чутливість), при незначній модифікації протоколу виробника шляхом виключення попереднього розведення зразка (див. Табл. 2).
• Чітко визначити мету дослідження, таку як нагляд чи моніторинг (скринінг) (Табл. 3).
• Запровадити стандартизований протокол, бажано відповідно до інструкцій виробника. Якщо необхідні зміни, їх слід суворо дотримуватися.
  Забезпечити комплексне навчання персоналу, включаючи правильні процедури збору зразків біопсії мозку.
• Продемонструвати адекватну ефективність ДСМП для варіантів мережі довідкових лабораторій СОЗТ з виявлення Сказу та видів тварин, найбільш релевантних для регіону, де проводиться дослідження. Це має включати попередню внутрішню оцінку державної референтної лабораторії по Сказу (Додаток 1).
• Ніколи не використовуйте негативний результат ДСМП, щоб відмовити особі, яка зазнала впливу, від отримання постконтактної профілактики (ПКП).
• Підтверджувати усі негативні результати дослідження, використовуючи рекомендовані СОЗТ лабораторні діагностичні методи, як зазначено в Главі 3.1.19. Сказ (зараження вірусом Сказу й іншими Ліссавірусами Посібника з діагностики й вакцинопрофілактики для наземних тварин СОЗТ.
• Повідомляти про позитивні результати ДСМП відповідно до стандартів Світова організація охорони здоров'я та Світової організації здоров’я тварин, що може потребувати підтвердження за допомогою офіційно визнаного дослідження.
• Забезпечення належного біозахисту, використання ЗІЗ та навчання для всіх користувачів дослідження збору зразків (Додаток 2).

З огляду на велику кількість ДСМП для виявлення Сказу на ринку й наближення їх до рекомендованих порогових значень, ретельний відбір є критично важливим. На сьогодні діагностична чутливість та специфічність (Табл. 2) були ретельно вивчені лише два ДСМП.

Таблиця 2. Порівняння двох ДСМП для швидкого виявлення антигену вірусу Сказу з підтвердженими даними валідації, що вказують на потенційну застосовність

*Поточні інструкції виробника, **Зміни в інструкціях виробника †Повідомлялося про перехресну реактивність та хибнопозитивні результати у кроликів від BioNote. Користувачам слід бути обережними під час інтерпретації результатів для видів, не зазначених в інструкції до упаковки. Наполегливо рекомендується провести внутрішню оцінку (див. Додаток 1).

Таблиця 3. Мережа довідкових лабораторій СОЗТ з виявлення Сказу рекомендує застосовувати ДСМП як окремий метод діагностики в ензоотичних щодо Сказу регіонах з низьким рівнем доходу.

*Якщо країна чи ветеринарний орган не визнали ДСМП як офіційний метод дослідження Сказу то ні позитивні, ні негативні результати ДСМП не мають використовуватися для офіційної статистики нагляду чи офіційного визначення стану хвороби на Сказ. І навпаки, якщо країна чи ветеринарний орган визнав ДСМП як офіційний метод дослідження Сказу, то позитивні результати мають бути включені до офіційної статистики нагляду.

Додаток 1. Мінімальні вимоги до оцінювання внутрішніх випробувань

Під час використання ДСМП як інструменту скринінгу вкрай важливо оцінити, чи здатне дослідження надійно виявити лінії вірусу Сказу, поширені в країні. Хоча цей процес не є повною валідацією, він надає цінну інформацію компетентним органам для визначення придатності дослідження для його цільового призначення. Кількість зразків, необхідних для внутрішньої перевірки, залежить від бажаного рівня чутливості, специфічності та статистичної вірогідності.

Наведений нижче приклад слугує загальною настановою для внутрішньої верифікації ефективності ДСМП:

Для оцінки діагностичного дослідження з чутливістю (Sn) 97% і специфічністю (Sp) 99%, необхідно включити як позитивні, так і негативні зразки. Sn (відсоток справжніх позитивних результатів) 97% означає, що 97% фактично позитивних зразків правильно розпізнаються як позитивні. З іншого боку, Sp (відсоток справжніх негативних результатів) 99% означає, що 99% істинно негативних зразків правильно ідентифікуються як негативні.

Для підтвердження чутливості 97% і специфічності 99%, з похибкою ±5% при рівні довіри 95%, слід дослідити щонайменше 45 позитивних і 15 негативних зразків зі 100% збігом між ДСМП з результатом золотого стандарту. На практиці кількість негативних зразків можна збільшити (до чотирьох разів порівняно із кількістю позитивних), оскільки їх зазвичай легше отримати.

Додаткові практичні міркування включають:

• Позитивні зразки: в ідеалі вони мають представляти однорідний розподіл з усіх частин країни й включати відомі чи ймовірні види-резервуари.
• Поширеність: частка позитивних і негативних зразків має відображати очікувану поширеність хвороби в цільовій популяції.
• Статистична вірогідність: хоча збільшення кількості зразків підвищує статистичну вірогідність, це не змінює основної інтерпретації чутливості й специфічності (Див. Мал. A1).

Малюнок A1. Вплив кількості досліджених зразків на чутливість і специфічність за наявності одного хибнопозитивного/хибнонегативного результату дослідження.

Стовпчики представляють 95% довірчі інтервали.

Оскільки позитивні й негативні зразки зазвичай не досліджуються разом під час одного сеансу, необхідно звернути увагу на фактори, що здатні вплинути на якість набору.

У цьому контексті мережа довідкових лабораторій СОЗТ з виявлення Сказу рекомендує державній референтній лабораторії по Сказу валідувати кожну нову партію ДСМП за допомогою референсної панелі (що включає негативні, і позитивні зразки) перед повторним випуском наборів для використання в на місці події.

Для отримання додаткової інформації щодо валідації діагностичних досліджень, зверніться, будь ласка, до. Глави 1.1.6. Посібника з діагностики й вакцинопрофілактики для наземних тварин СОЗТ.

Додаток 2. Загальні міркування відносно біозахисту

Заходи біозахисту під час використання ДСМП мають належним чином враховувати всі обґрунтовані занепокоєння, пов'язані із впливом вірусу Сказу. Персонал, залучений до дослідження на Сказ, має бути повністю поінформований про потенційні ризики, пов'язані зі збором зразків мозку й самою процедурою дослідження, а також має знати, як зменшити ці ризики перед початком будь-якого дослідження на Сказ. Усі зразки необхідно розглядати як потенційно небезпечні.

Перед дослідженням слід провести оцінку ризику, враховуючи:

• Стан вакцинації персоналу лабораторії, який проводить дослідження (тобто доконтактна імунізація проти Сказу та моніторинг титру антитіл).
• Коректні протоколи (наприклад, збір зразків мозку, протоколи дослідження, утилізація відходів та деконтамінація).
• Необхідні засоби індивідуального захисту (ЗІЗ).

З практичних міркувань слід розрізняти використання ДСМП й використання в біозахищеній камері. При дослідженні Сказу на місці події рекомендовано мінімальний комплект ЗІЗ включає лабораторний халат, рукавички, маски FFP2 та захисні окуляри або захисні щитки для обличчя.

По можливості, для ДСМП слід використовувати одноразові матеріали й пристрої. Однак, якщо використовується багаторазове обладнання, його після використання необхідно ретельно знезаразити за допомогою затвердженого дезінфектанту. Усі одноразові матеріали слід спалити чи автоклавувати перед утилізацією.

Компетентні органи можуть запроваджувати додаткові заходи біозахисту, якщо це вважається необхідним для зменшення ризику зараження вірусом Сказу.

ДСМП розроблені як швидкі польові дослідження, призначені для легкого й безпечного використання за умови суворого дотримання вищезазначених рекомендацій щодо біозахисту.

Посилання